賽默飛（Thermo Fisher）實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀是現代分子生物學(xué)中常用的分析工具之一，其廣泛應用于基因表達分析、病原檢測、突變檢測等研究領(lǐng)域。特別是其7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System），以其精確的溫控系統、靈敏的熒光信號檢測能力、以及用戶(hù)友好的操作界面，成為許多實(shí)驗室的設備。以下是關(guān)于7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的詳細使用步驟和原理說(shuō)明。

1. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡(jiǎn)介

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）是一種高靈敏度的基因擴增技術(shù)，通過(guò)熒光信號監測PCR反應過(guò)程中的DNA擴增。其基本原理是在PCR反應中加入帶有熒光標簽的探針或染料，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測熒光信號的變化，推測出目標DNA的初始數量。與傳統PCR不同，實(shí)時(shí)PCR能夠在PCR擴增過(guò)程中實(shí)時(shí)監測產(chǎn)物的數量，因此可以獲得更為精準的定量數據。

2. 賽默飛7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀概述

賽默飛7500型PCR儀采用先進(jìn)的光學(xué)檢測系統和精密的溫控系統，能夠提供高度精確的實(shí)驗數據。其主要特點(diǎn)包括：

• 多通道熒光檢測：7500型儀器具有多達6個(gè)熒光通道，支持不同熒光探針或染料的同時(shí)檢測，適用于多重PCR反應。

• 高效的熱循環(huán)系統：儀器采用精密的熱循環(huán)技術(shù)，溫控精度和均勻性較高，能夠確保擴增反應的高效進(jìn)行。

• 用戶(hù)友好的操作界面：7500型PCR儀配備大尺寸觸摸屏，操作界面直觀(guān)，支持數據實(shí)時(shí)顯示、分析與報告生成。

3. 設備安裝與準備

在使用7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之前，首先需要完成設備的安裝和調試工作。這些步驟包括：

3.1 安裝與檢查

• 位置選擇：選擇一個(gè)穩定、無(wú)強電磁干擾和溫度波動(dòng)的地方來(lái)放置PCR儀器。避免直射陽(yáng)光和震動(dòng)，確保設備的穩定性。

• 設備連接：連接電源線(xiàn)、計算機（如果需要）和網(wǎng)絡(luò )（如有需要）。確保所有連接無(wú)松動(dòng)。

3.2 啟動(dòng)與自檢

• 打開(kāi)設備電源，設備會(huì )自動(dòng)進(jìn)行自檢。此過(guò)程是為了確保硬件系統的正常運作，檢查如熱循環(huán)系統、熒光檢測系統等關(guān)鍵部件。

• 檢查液晶屏是否正常顯示，儀器是否能夠順利進(jìn)入操作界面。

4. PCR反應體系準備

4.1 樣品和試劑準備

• DNA模板：提取所需的DNA模板，通常需要在PCR前進(jìn)行核酸純化，確保模板的純度和濃度適合實(shí)驗要求。

• 引物和探針：根據實(shí)驗目的設計特異性的引物和探針。設計時(shí)需注意引物的長(cháng)度、GC含量、退火溫度等因素，以確保引物的特異性和擴增效率。

• PCR反應混合物：PCR反應體系一般包括模板DNA、引物、探針、熒光染料（如SYBR Green或TaqMan探針）、PCR緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶等。需要根據具體的實(shí)驗要求調整反應體系的組成。

4.2 配制反應液

• 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)或實(shí)驗設計配制PCR反應液，保證每個(gè)反應孔中加入合適量的反應液和模板。

• 一般來(lái)說(shuō)，反應液的總量可以根據實(shí)驗設計設置，通常每個(gè)反應孔的體積為20-50 μL。

4.3 樣品的加載

• 將配制好的反應混合物和模板按實(shí)驗設計分配到PCR板的各個(gè)孔中。確保每個(gè)孔的液體量一致，并且避免產(chǎn)生氣泡。

• 樣品加載完成后，使用PCR板封膜，確保密封良好。

5. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR程序設置

5.1 創(chuàng )建新實(shí)驗

• 在7500型PCR儀的觸摸屏上，選擇“新建實(shí)驗"選項。根據實(shí)驗的要求設置反應條件，如擴增循環(huán)數、退火溫度、熒光通道等。

• 選擇合適的PCR反應體系類(lèi)型，例如SYBR Green染料體系或TaqMan探針體系。

5.2 設置PCR程序

• 熱啟動(dòng)：大多數PCR反應體系需要在初始階段進(jìn)行熱啟動(dòng)，以激活DNA聚合酶，避免非特異性擴增。

• 擴增程序：設置適合的擴增程序，通常包括變性、退火、延伸三個(gè)步驟。對于SYBR Green染料體系，通常需要一個(gè)較長(cháng)的退火/延伸時(shí)間來(lái)確保信號的準確檢測。

• 數據采集：在每個(gè)擴增循環(huán)結束時(shí)，選擇熒光信號采集時(shí)間點(diǎn)。一般來(lái)說(shuō)，實(shí)時(shí)PCR儀會(huì )在延伸步驟后進(jìn)行熒光數據的采集。

5.3 啟動(dòng)實(shí)驗

• 在確認所有參數設置無(wú)誤后，點(diǎn)擊“開(kāi)始"啟動(dòng)PCR實(shí)驗。儀器將根據設置的程序自動(dòng)進(jìn)行反應。

6. 實(shí)驗結果分析與數據處理

6.1 實(shí)時(shí)數據監測

• 在實(shí)驗過(guò)程中，7500型PCR儀會(huì )實(shí)時(shí)顯示擴增曲線(xiàn)和熒光數據。用戶(hù)可以隨時(shí)查看實(shí)驗進(jìn)度和熒光信號變化。

• 在PCR反應過(guò)程中，隨著(zhù)擴增產(chǎn)物的增加，熒光信號逐漸增強。通過(guò)熒光信號的閾值設置，可以確定擴增的起始點(diǎn)（Ct值）。

6.2 數據分析

• Ct值分析：通過(guò)分析不同樣品的Ct值，可以確定目標基因的表達量或DNA的初始拷貝數。Ct值越小，表示樣品中目標基因的初始濃度越高。

• 標準曲線(xiàn)：為了定量測定目標基因的相對或絕對表達量，可以使用已知濃度的標準品來(lái)建立標準曲線(xiàn)，并通過(guò)該曲線(xiàn)來(lái)計算樣品中目標基因的濃度。

• 相對定量分析：在基因表達分析中，通常采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對定量分析。通過(guò)比較實(shí)驗組和對照組的Ct值，可以得出目標基因在不同樣本中的相對表達水平。

6.3 數據導出與報告生成

• 實(shí)驗完成后，用戶(hù)可以通過(guò)設備的分析軟件導出實(shí)驗數據并生成報告。報告中包含擴增曲線(xiàn)、Ct值、標準曲線(xiàn)等相關(guān)數據。

7. 實(shí)驗注意事項與故障排除

7.1 實(shí)驗注意事項

• 模板質(zhì)量：模板的質(zhì)量直接影響PCR的結果，應確保模板無(wú)污染且濃度適中。

• 引物設計：引物設計不合理可能導致擴增失敗或非特異性擴增，因此設計時(shí)要保證引物的特異性和二聚體形成的最小化。

• 反應體系：PCR反應體系需要根據試劑和樣品的具體情況進(jìn)行優(yōu)化，以提高擴增效率和信號的靈敏度。

7.2 常見(jiàn)故障與解決

• 無(wú)擴增或擴增信號弱：可能是模板量不足、引物設計不合理、PCR條件設置不當等問(wèn)題導致。應檢查模板質(zhì)量、引物特異性及PCR程序設置。

• 非特異性擴增：可以通過(guò)優(yōu)化引物退火溫度或使用特異性更強的探針來(lái)避免非特異性擴增。

• 熒光信號偏低：可能是染料添加量不足、熱循環(huán)條件不合適等原因導致。檢查熒光染料的濃度和PCR反應條件。

8. 總結

賽默飛7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀以其高精度的溫控系統和靈敏的熒光檢測能力，廣泛應用于基因表達分析、病原檢測、基因變異分析等研究領(lǐng)域。通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗條件和合理設計反應體系，研究人員可以獲得高質(zhì)量的定量PCR數據。